转染试剂JM2000

一、转染试剂通用操作步骤

1. 细胞准备

• 接种细胞至培养板/皿，使其在转染时密度达 50-80% 汇合度（具体因细胞类型而异）。

• 转染前更换为 无抗生素的培养基（抗生素可能干扰转染效率或增加毒性）。

2. 转染复合物制备

• 稀释核酸：将质粒DNA、siRNA或mRNA用无血清培养基或缓冲液稀释（如Opti-MEM）。

• 稀释转染试剂：将适量转染试剂单独稀释于同种无血清培养基中。

• 混合：将稀释的核酸与转染试剂按优化比例混合（如1:1-1:3，体积比），轻柔涡旋或吹打，室温静置 10-30分钟 形成复合物。

3. 转染

• 将复合物逐滴加入细胞培养基中，轻柔摇匀。

• 根据试剂要求选择是否更换为无血清培养基（部分试剂需血清，部分需去除）。

4. 培养与检测

• 4-6小时后 更换为含血清的正常培养基（减少毒性）。

• 24-72小时后 检测表达（荧光蛋白、Western blot、qPCR等）。

二、关键注意事项

1. 细胞状态

• 使用低传代数的健康细胞，污染或过度生长会显著降低效率。

2. 试剂保存与使用

• 脂质体类需 4℃避光保存，避免反复冻融；PEI可-20℃长期保存。

3. 优化条件

• 质粒DNA常用1-4 μg/孔（24孔板）；

• siRNA常用10-100 nM终浓度。

• 需预实验优化 核酸与试剂比例、细胞密度、转染时间。例如：

4. 核酸类型差异

• 质粒DNA：需高纯度（OD260/280≈1.8-2.0）。

• siRNA/mRNA：避免RNase污染，建议使用灭菌试剂。

5. 细胞毒性控制

• 复合物作用时间过长可能导致细胞死亡，需按时更换培养基。

6. 特殊细胞处理

• 难转染细胞（原代细胞、悬浮细胞）可能需要电转或病毒载体。

三、常见问题与解决

四、不同试剂的特性

• 脂质体法（如Lipofectamine 3000）：适合贴壁细胞，需无血清环境，操作简便但成本较高。

• PEI法：成本低，适合大规模转染，但需优化氮磷比（N/P比）。

• 磷酸钙法：适用于特定细胞（如HEK293），对pH值敏感，步骤较繁琐。

五、特殊应用提示

• 共转染：需调整不同质粒的比例（如报告基因与目的基因按1:5混合）。

• RNA转染：使用RNase-free耗材，避免反复冻融RNA。

建议初次使用时严格参照试剂说明书，并结合文献优化条件。遇到困难可尝试商业增强剂（如FuGENE HD）或细胞特异性转染方案。